卡博替尼与吉非替尼联合应用于ROS1融合克唑替尼耐药肺癌

为了开发ROS1融合肺癌患者的新治疗方法，研究了对克唑替尼耐药的机制。分析表明，卡博替尼和吉非替尼的组合在体外和体内均显示出对克唑替尼耐药细胞系的有益作用。

克唑替尼耐药HCC78R细胞中的表皮生长因子受体活化

为了探索耐药机制，使用携带SLC34A2-ROS1融合基因的HCC78细胞作为细胞系耐药模型。克唑替尼在纳摩尔水平抑制HCC78细胞的增殖，并且抑制亲本HCC78细胞中ROS1蛋白或下游信号蛋白的磷酸化。通过连续暴露于克唑替尼4个月从HCC78细胞建立耐药细胞系，然后将其命名为HCC78R。FISH分析表明，耐药细胞维持ROS1融合基因的程度与亲本HCC78细胞相同。HCC78R细胞中ROS1的RNA表达降低。与亲本HCC78细胞相比，HCC78R细胞中ROS1蛋白的表达也降低。

接下来，评估了下一代ALK抑制剂（包括ceritinib，brigatinib，alectinib和lorlatinib）对体外细胞系的影响。除了alectinib之外，所有抑制剂在纳摩尔水平都抑制了母体HCC78细胞的生长，而在HCC78R细胞中显示出的作用有限。ALK/EGFR抑制剂brigatinib在耐药细胞中表现出相对良好的抑制作用。在ROS1激酶结构域中，HCC78R细胞系均不存在获得性耐药突变，例如ROS1 S1986Y，S1986F，D2033N或G2032R。形态学检查未发现上皮-间充质转变的明显证据，并且蛋白质印迹实验证实，亲本HCC78和HCC78R细胞之间E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达模式相似。

随后，使用RTK阵列全面评估了HCC78细胞和HCC78R细胞中受体酪氨酸激酶（RTK）的磷酸化。结果表明，与亲本HCC78细胞中的磷酸化相比，在克唑替尼暴露条件下，HCC78R细胞中EGFR磷酸化维持相对较好。与HCC78细胞相比，HCC78R细胞中ERBB2和MET磷酸化水平显著降低。与亲本HCC78细胞相比，HCC78R细胞中AXL的磷酸化增加。

蛋白质印迹分析显示，在克唑替尼暴露下，HCC78R细胞中维持了EGFR和下游信号蛋白ERK1/2的磷酸化。总之，这些观察结果表明EGFR或AXL可能在HCC78R细胞的耐药机制中起作用。

AXL上调和HCC78R细胞对克唑替尼的耐药

为了进一步探索耐药机制，使用新一代测序对HCC78和HCC78R细胞进行RNA靶向序列分析。从培养皿中收集样本，其中独立培养HCC78细胞（n=4）或HCC78R细胞（n=4）。总结了612个人激酶组基因和激酶相关基因的mRNA表达水平。与HCC78R细胞相比，HCC78细胞9个基因（PLK1和2，PBK，AURKA，AURKB，TTK，CDK1，NEK2和AXL）的mRNA降低8倍；KDR，INSR，SBK1，EPHA4和TNIK基因的mRNA水平增加8倍。

在这些基因中，研究人员关注AXL，因为AXL的读取频率最高，并且HCC78R细胞中AXL磷酸化增加。与新一代测序数据一致，Western印迹分析显示，AXL蛋白显著增加。在HCC78R细胞中评估了2种AXL抑制剂卡博替尼（Cabozantinib，Cometriq，Cabozanib，Cabometyx，XL184）和gilteritinib的作用。

与EGFR抑制剂吉非替尼的作用相比，HCC78R细胞中卡博替尼和gilteritinib的作用相对有限。此外，克唑替尼与卡博替尼两者存在拮抗作用。相比之下，吉非替尼与卡博替尼或gilteritinib联合应用相比吉非替尼单药治疗可显著抑制细胞增殖。与这些观察结果一致，联合治疗相比单药疗法能够更强烈地抑制磷酸盐ERK1/2的激活。

此外，使用siRNA评估了吉非替尼与敲低AXL的组合效果。正如预期，HCC78R细胞中该组合相比单独AXL抑制对细胞增殖的抑制作用优异。最后，检查了体内联合治疗的效果。在HCC78R细胞的小鼠异种移植瘤中评估吉非替尼、卡博替尼及吉非替尼+卡博替尼联合治疗的效果。用载体（对照），克唑替尼（100mg/kg），吉非替尼（5mg/kg），卡博替尼（30mg/kg）或吉非替尼（5mg/kg）+卡博替尼（30mg/kg）治疗异种移植瘤。

载体或克唑替尼治疗的异种移植肿瘤显示出相似的生长速度，而卡博替尼对体内肿瘤生长的中等抑制作用。吉非替尼导致小鼠肿瘤的显著抑制。在携带HCC78R细胞的小鼠肿瘤中，吉非替尼+卡博替尼联合治疗也显示出比单药疗法更好的抑制效果，这种效果在统计学上不显著。在各组小鼠中没有观察到体重差异。

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